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Colorazione di Gram

 

Descrizione

La colorazione di Gram, per quanto riguarda la Microbiologia, è un esame di laboratorio che dà ragione della classificazione dei batteri in Gram-positivi e Gram-negativi (anche indicati come Gram+ e Gram-).

Fu messa a punto nel 1884 dal medico danese Hans Joachim Christian Gram, e mette in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi.

Con tale metodo è possibile esaminare sia batteri in coltura che frammenti di tessuti.

 

Significato biologico della colorazione

La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano (mureina) contenuto nella parete cellulare: i Gram-positivi presentano aminozuccheri N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico, ai quali sono legate corte catene di aminoacidi, che conferiscono stabilità e consistenza a tale strato. I Gram-negativi presentano invece una parete più sottile ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

 

Procedura

- Si pone nella piastra di coltura un colorante basico (idrofilo) (tra i più usati anche violetto di genziana o cristalvioletto e il violetto di nicolle);

- Passati i 3 min. si opera un lavaggio con liquido di Lugol (una soluzione di iodio e ioduro di potassio), che reagisce con il colorante basico formando un composto liposolubile, che si lascia agire per circa 1 minuto;

- Successivamente il materiale organico viene lavato con una soluzione decolorante (alcool etilico o simili) e infine con acqua.

 

A questo punto:

- i batteri Gram + hanno trattenuto il colorante basico (viola), poiché l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila) che non permette al colorante di passare;

- mentre i Gram - sono grigiastri, privi di colorazione, questo perché l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna e danneggiando la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso cristal violetto-ioduro (liposolubile).

- Infine, per far risaltare meglio la differenza si colora quindi il materiale con un colorante di contrasto, in genere safranina o fucsina (o eosina). La Safranina colora le cellule in rosso e l'Eosina in rosa.

Queste sostanze possono penetrare solo in cellule decolorate poiché, anche se solo modestamente idrofile, sono in grado di passare la Parete cellulare grazie alle loro ridotte dimensioni.

Dopo questo passo finale, i batteri Gram+ hanno colore violetto, mentre i Gram- hanno color rosso o rosa o alcune volte giallastro.

Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette gram-variabili.

La colorazione di Gram è una colorazione di tipo regressivo in quanto dopo una prima colorazione generale con violetto di nicole o di genziana, avverrà una decolorazione dei batteri Gram- con dell'alcool etilico puro, per poi essere ricolorati utilizzando della safranina.

 

Colorazione di gram di alcuni microrganismi comuni:

 

Famiglia

Gram

Aspetto

Informazioni

Rappresentanti

Micrococchi

+

cocchi a grappoli, ammassi

nelle salamoie, utili per la stagionatura degli alimenti

 

Stafilococchi

+

cocchi a grappoli, cubi (sarcine)

patogeni nel latte e derivati. Producono tossine.

Staphylococcus aureus

Bacilli

+

bastoncelli

provocano alterazioni in molti alimenti. Responsabili del carbonchio.

 

Clostridium

+

bastoncelli

provocano putrefazione e producono tossine negli scatolami

Clostridium tetani, Clostridium botulinum

Batteri propionici (corynebacteriaceae)

+

bastoncelli

danno le occhiature a formaggi come l'emmenthal o il grana

 

Micobatteri

+

bastoncelli

possono provocare o aggravare la tubercolosi o la lebbra

Mycobacterium tubercolosis

Brucella

-

bastoncelli

sulla pelle e nelle mucose

 

Coliformi

-

bastoncelli

possono provocare salmonellosi

Escherichia coli

Pseudomonas

-

bastoncelli

patogeni, nell'acqua e nel suolo

Pseudomonas aeruginosa

Aeromonas

-

bastoncelli

patogeni, nell'acqua e nel suolo

 

Ralstonia metallidurans

-

bacilli

sopravvivono anche in presenza di metalli pesanti

 

 

Batteri Gram negativi

Si definiscono Gram-negativi quei batteri che non rimangono colorati di blu o viola dopo aver subito la colorazione di Gram. Si contrappongono ai batteri Gram-positivi, che invece rimangono colorati alla fine del procedimento di Gram.

La parete delle cellule dei batteri gram negativi è molto complessa, la membrana esterna si trova al di fuori dello strato di peptidoglicano, e la proteina presente in maggior quantità è la lipoproteina di Braun, che presenta una terminazione idrofobica tramite la quale si lega alla membrana esterna. In questo modo la lipoproteina funge da legante fra la membrana esterna e lo strato di peptidoglicano. La membrana esterna presenta molte molecole grosse e complesse, denominate “lipopolisaccaridi (LPS)” suddivisi in tre complessi distinti:

- La regione del lipide A: costituita da un disaccaride con attaccati a ciascun carboidrato tre acidi grassi e fosfato, una cui parte si proietta dalla superficie verso l'esterno, mentre il resto del complesso è ancorato alla membrana esterna.

- Il nucleo polisaccaridico (o core): costituito da una catena di 10 zuccheri, è legato al lipide A. Esso contiene in genere zuccheri e fosfati caricati elettricamente, perciò contribuisce a rendere negativa la carica della superficie batterica.

- La catena laterale O, o antigene O: costituito da una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l’esterno; a seconda del ceppo batterico varia la sua composizione.

Gli anticorpi della cellula ospite sono in grado di riconoscere le catene laterali O, ma i batteri gram negativi sono in grado di modificare la natura delle catene laterali in modo da contrastare le difese dell’ospite.

Questo tipo di batteri è più resistente agli antibiotici perché nel periplasma sono presenti enzimi come la beta-lattamasi che distrugge l'anello beta-lattamico di alcuni antibiotici tra cui la penicillina.

 

Caratteristiche

Suddividere i batteri in funzione della colorazione che presentano dopo essere stati soggetti al metodo di Gram è il modo più utilizzato per suddividere i batteri, anche se ciò non include alcun grado di parentela tra le diverse specie batteriche.

I gram negativi si contraddistinguono, come detto, perché non mantenengono la colorazione dopo tattamento con il metodo di Gram. Dapprima trattate con cristalvioletto, le colture batteriche vengono lavate con un moderdenzante, il liquido di Lugol. Poi si utilizza un decolorante, per esempio alcol etilico. Se i batteri, dapprima colorati di viola o blu, dopo trattamento con decolorante perdono la colorazione, allora vengono definiti Gram negativi. Ciò è dovuto al fatto che i Gram negativi possiedono una sottile parete cellulare, che permette al colorante di penetrare e colorare la cellula, permettendo di seguito anche al decolorante di penetrare e decolorare la cellula. È questa sostanzialmente la differenza più grande che caratterizza e differenzia i Gram positivi dai Gram negativi.

 

Esempi di batteri Gram negativi

- Famiglia dei Enterobacteriaceae:

---- Genere Salmonella;

-------- Specie Escherichia coli;

-------- Specie Yersinia pestis (responsabile della peste);

- Famiglia dei Vibrionaceae:

-------- Specie Vibrio cholerae (responsabile del colera);

- Famiglia dei Pseudomonadaceae:

---- Genere Pseudomonas;

- Famiglia dei Neisseriaceae:

-------- Specie Neisseria meningitidis (responsabile della meningite batterica);

- Dichelobacter nodosus (patogeno zoologico).

 

Batteri Gram-positivi

Si definiscono Gram-positivi quei batteri che rimangono colorati di blu o viola dopo aver subito la colorazione di Gram. Si contrappongono ai batteri Gram-negativi, che invece subiscono la decolorazione.

 

Caratteristiche

Suddividere i batteri in funzione della colorazione che presentano dopo essere stati soggetti al metodo di Gram è il modo più utilizzato per suddividere i batteri, anche se ciò non include alcun grado di parentela tra le diverse specie batteriche.

I gram positivi si contraddistinguono, come detto, per mantenere la colorazione dopo trattamento con il metodo di Gram. Dapprima trattate con cristalvioletto, le colture batteriche vengono lavate con un mordenzante, il liquido di Lugol. poi si utilizza un decolorante, per esempio alcol etilico. Se i batteri rimangono colorati di viola o blu anche dopo essere stati trattati con il decolorante, vengono definiti Gram positivi. Ciò è dovuto al fatto che i Gram positivi possiedono una spessa parete cellulare esterna, che permette al colorante di penetrare e colorare la cellula, mentre impedisce al decolorante di penetrare e decolorare la cellula. È questa sostanzialmente la differenza più grande che caratterizza e differenzia i Gram positivi dai Gram negativi.

In linea generale i batteri gram positivi presentano le seguenti caratteristiche comuni:

  1. Membrana citoplasmatica lipidica;

  2. Parete di peptidoglicano;

  3. Capsula di polisaccaridi (presente solo in alcune specie);

  4. Flagello (anche questo presente solo in alcune specie).

 

Specie

Vengono qui di seguito elencate alcune delle specie positive alla colorazione di Gram:

- Staphylococcus;

- Micrococcus;

- Lactococcus;

- Lactobacillus;

- Clostridium;

- Bacillus;

- Streptococcus;

- Enterococcus;

- Listeria.

 

Voci correlate

- Microbiologia e Microrganismo;

- Regno Protista;

- Cellula;

- Patologia;

- Microscopio;

 

Tratto da Wikipedia, elaborato e modificato.